目錄生物化學(xué)影響因子 亞太生物學(xué)期刊影響因子 影響因子5左右的腫瘤雜志 光化學(xué)與光生物學(xué)雜志影響因子 生物學(xué)教學(xué)影響因子
期刊：Cell Reports；影響因子：8.109
發(fā)表單位：約翰霍普金斯大學(xué)等
高級漿液性卵巢癌（HGSC）是導(dǎo)致大多數(shù)與卵巢癌相關(guān)的死亡的最常見和致命的卵巢癌類型，了解卵巢癌發(fā)生、發(fā)展和治療敏感性的分子機制是進一步提高患者生存率的關(guān)鍵步驟。先前已有大規(guī)模的組學(xué)研究中對腫瘤組織進行了廣泛的分析，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組以及表觀修飾等，然而對于蛋白質(zhì)翻譯修飾而言，除磷酸化外，尚未在大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究中研究其他蛋白質(zhì)修飾。糖基化在癌癥發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，例如細胞間粘附、細胞生長、配體-受體結(jié)合和腫瘤轉(zhuǎn)移。與其他蛋白質(zhì)修飾相比，糖蛋白的分析由于糖蛋白結(jié)構(gòu)的巨大復(fù)雜性和異質(zhì)性而受到限制。糖蛋白組學(xué)技術(shù)的最新進展已使復(fù)雜糖蛋白的全面分析成為可能。
2020年10月發(fā)表在《Cell Reports》的一項研究中，利用蛋白質(zhì)組學(xué)和N-鏈接糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，地分析了83例HGSC患者腫瘤組織及23例健康輸卵管組織標本。研究提供了HGSC完整的蛋白組學(xué)和糖蛋白組學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)腫瘤中的糖蛋白在多個水平上受到調(diào)節(jié)，包括糖蛋白豐度、確定的特定糖位處糖基化的總體程度以及糖位處糖基化的類型，并揭示了以前從未研究過的蛋白質(zhì)糖基化在卵巢癌中的潛在功能。
由于一系列修飾，許多基因產(chǎn)物表現(xiàn)出極大的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性。這些修飾不是直接編碼在基因組模板中，但往往影響蛋白質(zhì)的功能。蛋白質(zhì)糖基化在蛋白質(zhì)正常功能中起著至關(guān)重要的作用。但是，與其他蛋白質(zhì)修飾（例如磷酸化）相比，糖蛋白的分析具有挑戰(zhàn)性。本研究對83個前瞻性收集的高級漿液性卵巢癌（HGSC）和23個非腫瘤組織進行了蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白組學(xué)的綜合分析，揭示了腫瘤特異性糖基化以及與三個腫瘤簇相關(guān)的不同糖基化，并鑒定了與糖基化改變相關(guān)的糖基化酶。
83個卵巢癌和23個相關(guān)非腫瘤組織的蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白組學(xué)；
糖基化與3個腫瘤簇相關(guān)；
糖蛋白和糖位的腫瘤特異性變化顯而易見；
確定負責(zé)糖基化改變余汪的酶。
收集了83例未經(jīng)治療的HGSC腫瘤和23例非腫瘤組織，用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)和N-連接糖蛋白組分析。總共鑒定出8144種蛋白質(zhì)，其中1690個含N-連接糖基的肽。根據(jù)已鑒定的N聯(lián)聚糖的單糖組成，定義了三種聚糖類型：低聚甘露糖/高甘露糖（HM），含有兩個N-乙酰基己糖胺（N）和己糖（H）而沒有另外的巖藻糖（F）或唾液酸（S）的聚糖；唾液酸化聚糖（Sia），代表任何含有S的聚糖；以及巖藻糖基化聚糖（Fuc），代表任何已鑒定的含有F的聚糖。
為了研究HGSC的迅毀橡癌癥異質(zhì)性，作者使用糖蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)進行聚類分析，鑒定了3種糖肽簇（IGP1-3）。通過計算了IGP簇與臨床表型的相關(guān)性，IGP3與腫瘤細胞數(shù)量呈負相關(guān)，與網(wǎng)膜的解剖部位呈負相關(guān)。功能分析顯示，IGP1富含溶酶體，IGP2中富含磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信號通路、粘著斑和細胞外基質(zhì)（ECM）-受體相互作用，IGP3富含補體和凝血級聯(lián)。結(jié)果還顯示了與IGP簇相關(guān)的聚糖，包括IGP1中的HM聚糖，IGP2中的HM和Fuc聚糖，IGP3中的Fuc和Sia聚糖。
先前研究已報道，IGP腫瘤簇與分化、免疫反應(yīng)、間充質(zhì)和增生等4種亞型有關(guān)。作者進一步探索本研究中IGP腫瘤簇與腫瘤亞型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)性亞型的特征蛋白在IGP簇1中升高，間充質(zhì)的特征蛋白在IGP2中降低而在IGP3中升高，這表明IGP1與免疫反應(yīng)性亞型有關(guān)，而IGP3與間充質(zhì)亞型有關(guān)。通過評估基質(zhì)細胞和免疫細胞對聚類結(jié)果的影響，IGP1簇似乎不受腫瘤純度或基質(zhì)評分的影響，IGP2具有相對較高的腫瘤純度和較低的基質(zhì)和免疫評分，IGP3具有較低的腫瘤純度和較高的基質(zhì)和免疫評分。
蛋白糖基化水平的主成分分析（PCA）顯示，腫瘤和非腫瘤樣本存在明顯界限。與非腫瘤樣品相比，在腫瘤中48個糖肽顯著上調(diào)，而94個糖肽顯著下調(diào)。為了尋找對卵巢癌診斷的可能有用的差異糖蛋白，作者使用受試者工作特性曲線評估了糖肽特征，顯示HYOU1、FKBP10、PSAP和PPT1能夠?qū)δ[瘤和非腫瘤組織進行良好分類。功能分析顯示，溶酶體是腫瘤畝旁樣品中顯著上調(diào)的糖肽富集的通路，而補體和凝血級聯(lián)通路、ECM-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、局灶性在腫瘤樣品中被下調(diào)糖肽富集。比較腫瘤樣品和非腫瘤樣品之間糖肽的相對豐度，觀察到帶有HM型聚糖的糖肽在腫瘤中具有更高豐度，而含有Fuc和Sia的糖肽在腫瘤中豐度低。含HM、Fuc或Sia的糖肽涉及的途徑表明，溶酶體途徑是含HM的糖肽中最富集的途徑，Euc糖肽富集ECM-受體相互作用，Sia糖肽富集凝血級聯(lián)反應(yīng)。
比較腫瘤和非腫瘤樣品中蛋白糖基化和蛋白表達，糖基化位點和糖蛋白在腫瘤中顯示出不同的調(diào)節(jié)水平，糖蛋白可能受糖基化占有率以及整體蛋白表達的調(diào)控。盡管含糖基肽的大多數(shù)差異豐度變化仍與相應(yīng)的整體蛋白表達正相關(guān)，但某些糖蛋白糖基的豐度變化可能顯示出與其全局水平不同的表達模式。例如，卵巢癌的生物標志物之一MCU16，在HGSC和健康輸卵管中蛋白表達量相近，但其兩個糖修飾位點MUC16_12272和MCU16_12586的糖基化修飾水平則在HGSC中明顯升高，這表明簡單地測量蛋白質(zhì)豐度和隨后的基于蛋白質(zhì)的聚類可能不足以全面了解腫瘤生物學(xué)。與非腫瘤相比，腫瘤中糖肽的豐度變化不僅受每個糖位處的糖基化反應(yīng)程度的調(diào)節(jié)，也受到修飾糖位的聚糖的影響。含HM聚糖的糖肽在腫瘤中大多過表達，而含其他類型含聚糖的糖肽的豐度變化則各不相同，并觀察到在相同糖位上糖基化的異質(zhì)性。
為了研究聚糖表達的調(diào)節(jié)，作者將糖肽數(shù)據(jù)集中每個腫瘤和非腫瘤樣品中糖肽的豐度與從蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集中確定和量化的糖基化酶的蛋白質(zhì)豐度進行了關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)具有HM聚糖糖基化的糖肽與糖苷酶2亞基β（PRKCSH）的表達呈正相關(guān)。同時，在所有已識別的糖基化酶中只有PRKCSH被發(fā)現(xiàn)在腫瘤中顯著上調(diào)，經(jīng)HM聚糖修飾的糖肽在腫瘤樣品中增加。
為了確定HM修飾對糖蛋白的潛在作用，作者分析了部分糖基化生物合成途徑以合成具有關(guān)鍵糖基化酶功能的HM。腫瘤細胞中PRKCSH表達的增加可能導(dǎo)致具有HM糖基化的糖蛋白升高，從而阻止了進一步詳細的復(fù)雜碳水化合物合成。HM聚糖修飾的這種增加對于為腫瘤生長大量合成的糖蛋白可能至關(guān)重要，對癌細胞中被HM修飾的糖蛋白網(wǎng)絡(luò)的研究可能有助于鑒定快速細胞生長所需的糖蛋白。通過蛋白網(wǎng)絡(luò)分析，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤中上調(diào)的HM糖蛋白質(zhì)參與了一個主要與溶酶體、膠原代謝過程和內(nèi)膜有關(guān)的網(wǎng)絡(luò)。總之，通過分析由HM聚糖修飾的糖肽，該研究確定了糖蛋白是癌癥發(fā)展所需的潛在靶標。
在這項研究中，綜合的多組學(xué)分析，包括HGSC的蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白組學(xué)分析，證明了糖基化與卵巢癌的聯(lián)系。通過應(yīng)用多組學(xué)數(shù)據(jù)在腫瘤和非腫瘤之間的差異表達，鑒定了幾種潛在的腫瘤特異性蛋白，糖蛋白和聚糖。進一步的研究表明，腫瘤中糖蛋白表達的差異可以表現(xiàn)為糖位處糖基化程度的差異以及糖位上聚糖的類型。腫瘤的糖基化生物合成途徑不同于非腫瘤，由于PRKCSH的上調(diào)，N-連接的糖蛋白在腫瘤中可以攜帶更多的HM聚糖，這可能是PRKCSH調(diào)節(jié)腫瘤中有效糖蛋白產(chǎn)生、抗環(huán)境壓力和溶酶體過度活化的常見機制。總之，HGSC腫瘤樣品的綜合蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)測量提供了寶貴的公共資源，將糖蛋白與其糖基化程度、聚糖修飾和糖基化酶聯(lián)系起來的糖蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)將改善未來對卵巢癌分子基礎(chǔ)的了解。
腫瘤生物消毀學(xué)指研究腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制，以及腫瘤防治的生物科學(xué)：地介紹腫瘤細或改胞的衫橋判結(jié)構(gòu)性改變以及由此產(chǎn)生的功能改變，及腫瘤的一般生物學(xué)特點，另外包括腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)、腫瘤的防治及相關(guān)知識等。
A Tuft Cell-Like Signature Is Highly Prevalent in Thymic Squamous Cell Carcinoma and Delineates New Molecular Subsets Among the Major Lung Cancer Histotypes
胸腺鱗狀細胞癌中高度流行一種類似于Tuft細胞的特征，并在主要的肺癌組織型中劃分出新的分子亞型
發(fā)表期刊：J THORAC ONCOL
發(fā)表日期：2021 Feb 17
影響因子：13.357
DOI:10.1016/j.jtho.2021.02.008
一、研究背景
胸腺上皮瘤（TETs）包括胸腺瘤和侵襲性較強的胸腺昌梁癌（TCs）。胸腺瘤根據(jù)新生上皮細胞的組織形態(tài)和未成熟T細胞的比例，可分為A型、AB型、B1型、B2型、B3型和其他罕見類型。TCs的分化程度不一，但胸腺鱗狀細胞癌（TSQCCs）約占80%的病例。由于它們的罕見性和代表性細胞系的匱乏，現(xiàn)階段對TETs的生物學(xué)認識不足。手術(shù)以外的治療仍然主要是經(jīng)驗性的，有效的長期治療方案螞鉛是不可用的。
二、材料與方法
1數(shù)據(jù)來源
1）TCGA：胸腺瘤（也包括TC）（N = 117，包括A型(N = 10)、AB型(N = 48)、B1型(N = 12)、B2型(N = 25)、B3型(N = 10)、微結(jié)節(jié)胸腺瘤(N = 2)和TCs(N = 10)），肺SQCC和肺腺癌。
2）GSE57892：包含22例TETs型A(N = 5)、AB(N = 2)、B2(N = 3)和B3胸腺瘤(N = 5)和TC(N = 7)
3）George等人提供的66例肺LCNECs
4）RT-qPCR：60個速凍的TETs病例
5）免疫組化的分析：該隊列包括胸腺瘤、胸腺和非胸腺SQCCs以及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（NENs）
2分析流程
1）RT-qPCR、IHC、Western Blotting
2）統(tǒng)計分析：Wilcoxon檢驗、Student's t檢驗、chi-square檢驗、Fisher's exact檢驗、無監(jiān)督聚類、富集分析、生存分析
3）胸腺濾泡細胞耐物運表達試劑盒：根據(jù)最近發(fā)表的小鼠胸腺上皮細胞（TEC）亞集（GSE114651）的基因表達標志，16 KIT，人TC標記的小鼠同源物KIT的mRNA表達水平在小鼠胸腺Tuft細胞中高于其他mTEC亞集和皮質(zhì)TECs。這一發(fā)現(xiàn)促使作者調(diào)查已發(fā)表的人類胸腺瘤和TCs的基因表達數(shù)據(jù)集，以獲得Tuft細胞標記物。
三、結(jié)果展示
01 -TCs在mRNA水平上表達胸腺濾泡細胞相關(guān)基因
搜索TCGA 數(shù)據(jù)集的胸腺瘤和TCs的24個基因的mRNA表達水平，這些基因在正常的小鼠胸腺Tuft細胞中特征性地表達，但不在其他正常TEC亞集，作者發(fā)現(xiàn)TCs經(jīng)常表達這些基因。
POU2F3，Tuft細胞的主調(diào)節(jié)器，和ALOX5，GFI1B，CHAT和L1CAM的表達水平顯著高于TCs比A型（CHAT除外），AB和B1-3胸腺瘤（圖1）。通常局限于正常皮質(zhì)TEC和非tuft細胞mTEC亞群15的基因在TC中的表達與胸腺瘤相比沒有顯著升高（補充圖3A）。在Petrini等人提供的獨立TET數(shù)據(jù)集中也觀察到TC中Tuft細胞標志物的上調(diào)（補充圖3B）。最后，在60個速凍TET隊列中，RT-qPCR分析證實，兩個關(guān)鍵的Tuft細胞標志物POU2F3和GFI1B的表達水平在TCs中顯著高于A型、AB型、B1型、B2型和B3型胸腺瘤（圖2A）。
02 -TSQCCs普遍表達關(guān)鍵的Tuft細胞蛋白，POU2F3和GFI1B
124例福爾馬林固定、石蠟包埋的TET（包括上述速凍病例中的部分（60例中的7例））的IHC顯示，雖然陽性細胞的比例不一（圖2C），但幾乎所有的胸腺瘤和胸腺NENs都是陰性的，但約70%的TSQCC中都有POU2F3蛋白表達（圖2B）。同樣，GFI1B的表達在TSQCC和其他TET亞型之間有顯著差異，但GFI1B陽性TSQCC的比例低于POU2F3陽性TSQCC。POU2F3和GFI1B的IHC也成功標記了胰腺中的正常Tuft細胞。
與TSQCC相反，來自其他器官的SQCCs和NENs通過IHC呈POU2F3陰性。值得關(guān)注的是，皮膚SQCCs也是POU2F3陰性，盡管POU2F3在正常角質(zhì)細胞中表達（圖2B）。
03 -Tuft細胞樣和非Tuft細胞樣的TSQCCs代表不同的子集
作者的TSQCC病例中共有30%，TCGA聯(lián)盟和Petrini等的隊列中也有類似數(shù)量的病例表現(xiàn)出非Tuft細胞樣表型（圖3A和補充圖3B）。對所有胸腺瘤和TSQCC的全局基因表達譜進行分層聚類，發(fā)現(xiàn)所有的Tuft細胞樣TC都聚成一個組，雖然非Tuft細胞樣TC分散在胸腺瘤中（圖3B）。在驅(qū)動基因突變和臨床發(fā)現(xiàn)方面，兩組的規(guī)模太小，無法得出有意義的結(jié)論（補充圖5A和B）。相比之下，TC中最常見的染色體異常--16q的丟失，在所有的Tuft細胞樣TC中觀察到，但在TCGA和Petrini等的聯(lián)合隊列中的非Tuft細胞樣TC中都沒有（圖3A和補充圖5D）。
04 -TC的Tuft細胞樣表型與KIT的表達密切相關(guān)
比較POU2F3和GFI1B的mRNA表達水平和TSQCCs的經(jīng)典診斷標記基因、KIT和CD5，在作者和Petrini等的隊列中，這兩個Tuft生細胞標記物與KIT和CD5的水平有中等至強的相關(guān)性，但在TCGA數(shù)據(jù)集中的相關(guān)性較低。此外，在TCGA和Petrini等以及作者的隊列中，Tuft細胞標志物和KIT表達的相關(guān)性始終很高，且強于Tuft細胞標志物和CD5之間的相關(guān)性（補充圖5C、5E和6A）。
在蛋白質(zhì)水平上，從免疫組化隊列中隨機選擇的24個TSQCC中，有12個共表達POU2F3、KIT和CD5，所有POU2F3陽性的病例(N＝17)均表達KIT，盡管12個也是CD5陽性(補充圖6B和C)。總之，KIT的表達與TCs的Tuft細胞樣表型的相關(guān)性比CD5的表達更強。
05 -一種類似于Tuft細胞的特征和KIT的表達表征了NSCLC的子集
接下來對肺癌的TCGA數(shù)據(jù)進行分析，尋找簇細胞樣mRNA信號。在TET結(jié)果的基礎(chǔ)上，經(jīng)驗性地定義簇細胞樣腫瘤為POU2F3和GFI1B的mRNA表達z得分均大于2（因此稱為POU2F3和GFI1B共表達者）。
來自TCGA隊列的484個肺SQCCs中，共有9個是POU2F3和GFI1B共表達者，這個子集不僅發(fā)現(xiàn)其他Tuft細胞標志物上調(diào)，而且還發(fā)現(xiàn)KIT上調(diào)（圖4A和補充圖7A）。對全局基因表達譜進行分層聚類發(fā)現(xiàn)，9個簇細胞樣肺SQCC中的8個聚成一個組，表明它們形成了一個獨特的亞型（圖4A）。
利用基因本體富集分析，發(fā)現(xiàn)與細胞核相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，尤其是轉(zhuǎn)錄因子，在叢生細胞樣肺SQCCs中顯著富集（圖4B），強調(diào)它們在轉(zhuǎn)錄本水平上與非叢生細胞樣肺SQCCs不同。在基因水平上，RB1失活突變在tuft細胞樣亞組中顯著更常見，盡管TP53突變在兩個亞組中同樣分布（圖4C和補充圖7B）。
分析TCGA數(shù)據(jù)集提供的虛擬組織學(xué)切片，簇細胞樣肺SQCCs的分化普遍比非簇細胞樣病例差，9例中僅有3例表現(xiàn)為局灶性角化（補充圖7D）。在臨床上，女性和重度吸煙者在tuft細胞樣肺SQCCs中的比例過高（圖4D）。雖然在TCGA隊列中發(fā)現(xiàn)簇細胞樣肺SQCCs的階段明顯較低，但沒有發(fā)現(xiàn)顯著的生存差異（圖4D和補充圖7D）。
在510個TCGA肺腺癌中，有3個是Tuft細胞樣腫瘤，與它們的SQCC對應(yīng)物相似，它們表達KIT，聚集在一起(補充圖7E)，顯示RB1拼接突變或深度缺失以及TP53突變(補充圖7F)，并且在組織學(xué)上分化較差(補充圖7G)。事實上，在對合并的肺SQCCs和腺癌的TCGA數(shù)據(jù)集進行層次聚類分析時，兩個隊列的叢細胞樣子集聚成一個組，表明它們的腫瘤生物學(xué)相似（圖4E）。
分析了George等人提供的數(shù)據(jù)集，根據(jù)mRNA表達的絕對值確定了12個POU2F3和GFI1B共表達者和54個非簇細胞樣病例（圖5A）。前者顯著共表達其他簇細胞制造者和KIT，12例中有8例在基因表達分析上聚成一個小群(圖5A)。與之前對SCLC的研究一致，19例簇細胞樣LCNECs不表達Rudin等提出的其他3個POU2F3陰性SCLC亞組的主轉(zhuǎn)錄因子，神經(jīng)內(nèi)分泌標志物CHGA和SYP的表達水平明顯低于非簇細胞樣LCNECs（圖5B）。
與簇細胞樣肺SQCC和腺癌相似，簇細胞樣肺LCNEC常有TP53和RB1突變，且RB1突變頻率明顯高于非簇細胞樣隊列。此外，LCNEC整體典型的STK11熱點突變，在所有簇細胞樣LCNEC中都不存在（圖5C）。盡管存在這些分子差異，但兩組之間的臨床特征并無不同（圖5D）。
四、結(jié)論
本研究中，作者報告了tuft細胞相關(guān)基因，特別是POU2F3和GFI1B，在大多數(shù)TSQCCs中高表達。此外，肺鱗狀細胞癌(SQCC)、腺癌和大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌(LCNECs)等較小的子集也表達了類似tuft細胞的特征。總之，tuft細胞樣表型確定了TSQCCs的一個新的亞組和不同的肺癌類型，具有不同的分子和病理特征。這種特征伴隨著獨特的臨床、組織學(xué)和遺傳學(xué)特征，表明它在各自的癌癥類型中劃分了生物學(xué)上相關(guān)的子集。
我現(xiàn)在搞清為什么醫(yī)學(xué)期刊影響因子高。影響因子=被引用數(shù)/發(fā)表數(shù)(指兩年內(nèi))，如某期刊上一年文章只被本期刊第二年引用，那么理論渣蠢改上最高影響因子=1，如果某學(xué)科只有一個期刊，則該學(xué)科影因最多為1。這樣看醫(yī)學(xué)類有檔陪影因30的期刊，說明該學(xué)科同類期刊至少30個。所以影響因子高只能說明該學(xué)科期刊多并非人氣旺如判。公平的指標=影響因子/本學(xué)科期刊總數(shù)。一本期刊ㄧ次刊登100篇文章不如分成10種期刊每種ㄧ次刊登10篇，影響因子立馬增10倍。
An independent poor-prognosis subtype of breast cancer defined by a distinct tumor immune microenvironment
一種由獨特的腫瘤免疫微環(huán)境定義的獨立貧血亞型乳腺癌
發(fā)表期刊：Nat Commun
發(fā)表日期：2019 Dec 3
影響因子：12.121
DOI:10.1038/s41467-019-13329-5
一、研究背景
腫瘤微環(huán)境影響癌癥的起始和進展。在乳腺癌中，臨床病理特征，如年齡，等級，階段和分子亞型與預(yù)后有關(guān)，并驅(qū)動治療決策。5種臨床相關(guān)的分子亞型：Luminal A、Luminal B、Her2富集型、基底樣型和正常樣型，其發(fā)病率、生存率、預(yù)后和腫瘤生物學(xué)特性各不相同。
除了癌細胞生物學(xué)因素外，炎中歲癥微環(huán)境也影響著腫瘤的起始和進展。癌細胞周圍的免疫微環(huán)境可以識別和抑制腫瘤生長或促進進展。在乳腺癌中，高免疫浸潤已與更好的臨床結(jié)果。此外，高免疫浸潤已與新輔助和輔助化療的反應(yīng)增加相關(guān)。
二、材料與方法
1數(shù)據(jù)來源
1）基因表達：手術(shù)收集的MicMa隊列（其中的子集用于分析， MicMa-nCounter（n = 96，F(xiàn)FPE），MicMa-Agilent（n=104，新鮮冷凍組織））
2）RNA-seq：OSLO2-EMIT0隊列（GSE135298，原始數(shù)據(jù)在EGAS00001003631）
3）公開的數(shù)據(jù)：表達數(shù)據(jù)從GEO、European Genome-phenome Archive、ArrayExpress或TCGA獲得；METABRIC隊列
2分析流程
1）基因集富集分析
2）無監(jiān)督聚類獲得免疫簇：基于509個基因，使用R包pheatmap對患者的相關(guān)性矩陣進行層次聚類
3）Nanodissect：用于淋巴和髓細胞浸潤的預(yù)測，淋巴細胞或骨髓細胞浸潤的nanodissect分數(shù)反映了樣本中各自基因的平均表達量
4）CIBERSORT（22種類型的浸潤性免疫細胞的絕對比例）、ssGSEA（上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細胞、增殖和細胞周期相關(guān)途徑的基因集）
5）二項式邏輯回歸預(yù)測免疫集群：R包glmnet （構(gòu)建模型公式）
6）免疫浸潤的病理評估
7）ROR評分：ROR-Score=0.05×Basal+0.12×Her2-enriched???0.34×Luminal A+0.23×Luminal B；其中，基底、Her2富集、管腔A和管腔B是每個樣本與R中使用genefu包獲得的質(zhì)心的相關(guān)性
8）統(tǒng)計學(xué)、生存分析、多變量Cox回歸分析
三、結(jié)果展示
01 -乳腺癌的免疫簇并反映了逐漸的免疫浸潤
測量了MicMa隊列的95個腫瘤樣本中760個基因的表達，該陣列旨在剖析實體腫瘤中的免疫浸潤。這95個樣本中的79個樣本之前已經(jīng)通過Agilent全基因組4×44K寡核陣列進行了剖析。首先使用Pearson和Spearman相關(guān)性比較了兩個獲得的表達，發(fā)現(xiàn)基因的表達值之間存在高度的正相關(guān)（補充圖1A）。
為了根據(jù)免疫相關(guān)基因表達的相似性對患者進行分組，對相關(guān)矩陣進行了無監(jiān)督的分層聚類（圖1a和補充圖1B）。從3到10個聚類的輪廓圖分析表明，3個聚類最好地捕獲了nCounter和Agilent數(shù)據(jù)集的分割（補充圖1C，D）。比較了兩個數(shù)據(jù)集MicMa-nCounter和MicMa-Agilent的聚類結(jié)果。在這兩個數(shù)據(jù)集中，有79個樣本是重疊的。隨著用于測量基因表達的不同，以及基因列表和用于執(zhí)行無監(jiān)督聚類的樣本的不完全重疊，仍然發(fā)現(xiàn)79個重疊樣本的聚類分配顯著相似。
為了確認集群與腫賣含睜瘤免疫微環(huán)境相關(guān)（圖1b），使用算法Nanodissect為總淋巴細胞和骨髓細老橋胞浸潤打分。Nanodissect評分首先在MicMa隊列中使用有經(jīng)驗的病理學(xué)家分析的匹配蘇木精和曙紅切片的免疫浸潤評估進行驗證（圖1c和補充圖1E）。發(fā)現(xiàn)這三個簇與Nanodissect淋巴細胞（圖1b）和骨髓細胞（補充圖1F）評分顯著相關(guān)。得出結(jié)論，簇A-C反映了逐漸的免疫浸潤，因此被稱為免疫簇。
使用其他9個隊列的表達數(shù)據(jù)驗證了這些簇與淋巴/髓細胞浸潤之間的關(guān)聯(lián)。有509個基因在所有研究的數(shù)據(jù)集中被發(fā)現(xiàn)，被用于無監(jiān)督聚類（圖1d和補充圖2A，分別用于METABRIC和TCGA隊列的聚類）。在每個隊列中，所得到的三個聚類與淋巴和骨髓Nanodissect評分顯著相關(guān)（圖1e；補充圖2B）。淋巴和髓細胞浸潤從簇A（藍色；低浸潤；冷腫瘤）逐漸增加到簇B（淺藍色；中等浸潤）和簇C（粉紅色；高浸潤；熱腫瘤）。
對于額外的一層驗證，使用METABRIC隊列中免疫浸潤的病理評估，這與Nanodissect評分（圖1f和補充圖2C）和免疫簇顯著相關(guān)。使用PanCancer免疫剖析陣列的基因進行無監(jiān)督分層聚類，可以根據(jù)免疫浸潤的漸進水平對乳腺癌腫瘤進行分組。
02 -免疫簇與預(yù)后相關(guān)
對于兩個最大的隊列METABRIC(n = 1904)和TCGA(n = 981)，發(fā)現(xiàn)簇B(具有中等水平的免疫浸潤)與更差的預(yù)后相關(guān)(補充圖3A，B)。當(dāng)分別對ER陰性（補充圖3C，D）和ER陽性（補充圖3E，F(xiàn)）的病例進行分層時，也觀察到簇B病例的這種更差的結(jié)果。為了完善觀察結(jié)果，根據(jù)簇B（淺藍色）與簇A和簇C（紫色）繪制了患者生存期圖，并證實簇B患者的預(yù)后明顯且顯著惡化（圖2）。用相關(guān)生存數(shù)據(jù)在另外四個隊列中進一步驗證了這一結(jié)果。結(jié)論是免疫簇與ER陰性和ER陽性乳腺癌的預(yù)后相關(guān)。
03 - 用二項式邏輯回歸預(yù)測免疫簇
基于免疫聚類的臨床相關(guān)性，旨在開發(fā)一種通用的方法，能夠準確而敏感地預(yù)測患者的預(yù)后較差的分類，而不必依賴于無監(jiān)督聚類。作者使用二項式邏輯回歸，通過lasso進行懲罰，得到一組基因，這些基因可以敏感和特異地預(yù)測一個樣本是否屬于簇B，通過接收者操作特征曲線和曲線下面積（AUC）分析評估（圖3a）。96.3%的樣本被模型預(yù)測為簇A和簇C，而68.8%的樣本分到了簇B（圖3b）。
通過比較生存期對數(shù)秩檢驗p值，發(fā)現(xiàn)lasso分類普遍改善了免疫簇與生存期之間的顯著關(guān)聯(lián)。lasso模型在另外5個隊列中得到了驗證。圖3c-e為STAM(n = 856)、MAINZ(n= 200)和UPSA(n = 289)，補充圖5A、B為CAL(n = 118)和PNC(n= 92)。
由于二項式邏輯回歸只預(yù)測了兩個簇（簇B與簇A和簇C），進行了另一輪二項式邏輯回歸，以高準確度區(qū)分簇A和簇C（補充圖5C，D）。
04 -免疫簇，一個獨立的預(yù)后因素
作者進一步研究了免疫簇與乳腺癌中著名的臨床病理特征（大小、年齡、等級、階段、淋巴結(jié)受累和分子亞型（PAM50））的關(guān)系。簇A（免疫浸潤度低）富含ER陽性和Luminal病例，而簇C（免疫浸潤度高）中ER陰性和Basal樣病例比例較高，ER陰性和ER陽性樣本以及PAM50亞型在預(yù)后不良的簇B中同樣占有一定比例（圖4a，b）。
使用多變量Cox回歸分析測試了免疫簇的預(yù)后影響，同時考慮了其他預(yù)后因素。發(fā)現(xiàn)免疫簇是模型生存的重要因素，如每個隊列Cox模型中與免疫群相關(guān)的顯著p值所示。為了進一步檢驗免疫簇作為重要的預(yù)后生物標志物的優(yōu)勢，采用了逐步回溯選擇的方法。對于所有隊列，免疫簇被保留在最佳擬合的最小模型中，在11個隊列中的9個隊列中，免疫簇是一個顯著的預(yù)后變量。
05 -具有復(fù)發(fā)風(fēng)險（ROR）評分的新RNA-seq數(shù)據(jù)集的驗證
EMIT0，這是OSLO2隊列研究的一個子集，OSLO2-EMIT0由食品和藥物管理局批準的Prosigna復(fù)發(fā)風(fēng)險（ROR）分數(shù)評估，ROR評分在標準的臨床病理特征之上增加了重要的預(yù)后信息。發(fā)現(xiàn)簇B組成的樣本與簇A和C相比具有中間的ROR評分（圖4c），表明與簇B相關(guān)的不良預(yù)后不可能由ROR評分中包含的信息來解釋。當(dāng)分別評估ER陰性（補充圖7A）和ER陽性（補充圖7B）病例時有同樣結(jié)果。對于所有隊列通過已有方法計算ROR評分，該方法與PAM50亞型有關(guān)，并證實簇B由中間ROR評分組成（圖4d和補充圖7C，D）。
多變量回歸分析證實，免疫簇為ROR評分帶來了額外的預(yù)后價值，這體現(xiàn)在用ROR評分和免疫簇建立生存模型時，免疫簇的p值顯著。通過計算凈重分類改善（NRI）和綜合判別改善（IDI）指數(shù)，強調(diào)了免疫簇與ROR評分一起使用時，根據(jù)生存率對患者進行分類的額外價值，正如所有隊列中NRI和IDI系數(shù)為正值所示。NRI和IDI的置信區(qū)間（CI）構(gòu)建的Bootstrapping顯示，對于幾個隊列，免疫簇與ROR評分相加時，顯著改善了患者根據(jù)預(yù)后的分類。
06 - 免疫簇和對新輔助化療的反應(yīng)
進一步評估了免疫簇與新輔助化療反應(yīng)之間的關(guān)系，使用了來自8項研究（1377個樣本）的基因表達數(shù)據(jù)，并使用lasso將每個樣本分配給其所屬的免疫簇。如圖4e，發(fā)現(xiàn)簇C應(yīng)答者百分比最高，其次是簇A，簇B應(yīng)答者百分比最低。還計算了每個組中應(yīng)答者的百分比：簇C平均有42%的應(yīng)答者和58%的殘余疾病患者，而簇B有18%/82%的應(yīng)答者和13%/87%的殘余疾病患者。由于pCR率作為ER狀態(tài)的函數(shù)不同，還獨立計算了ER陽性和ER陰性病例的應(yīng)答者比例，發(fā)現(xiàn)無論ER狀態(tài)如何，簇B的應(yīng)答者比例最低（分別為補充圖8A、B）。
對于每個對新輔助化療有反應(yīng)的隊列，評估了pCR和非pCR病例在各免疫群中的分布。當(dāng)考慮整個隊列時，發(fā)現(xiàn)應(yīng)答者在各免疫群組的分布有顯著不同，簇B的應(yīng)答者較少，簇C組的應(yīng)答者居多；當(dāng)按ER狀態(tài)拆分時，雖然并非總是顯著，但也觀察到同樣的趨勢。這些結(jié)果表明，簇C中的患者有更高的概率成為應(yīng)答者。研究結(jié)果還突出了簇B的低響應(yīng)率，表明這類患者可能是新的新輔助治療方案測試的候選人。
07 - 免疫簇的計算機剖析
為了評估集群中的逐漸免疫浸潤是否可以解釋與預(yù)后的關(guān)聯(lián)，在Cox多變量回歸分析中測試了免疫集群或總免疫浸潤評分中哪一個對生存更有預(yù)測性。作者假設(shè)特定的免疫細胞類型混合物，而不是腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞總數(shù)，可能是簇B預(yù)后差的原因。
使用CIBERSORT算法估計22種不同的免疫細胞類型的比例，對這種細胞類型特異性中位數(shù)浸潤分數(shù)進行無監(jiān)督聚類（圖5a）。簇C病例中，富集了巨噬細胞M1、記憶激活T細胞和濾泡T輔助細胞（圖5a），METABRIC和TCGA隊列中CIBERSORT評分的分布也說明了這一點（圖5b）。簇A如預(yù)期的那樣，免疫細胞的水平非常低。在反應(yīng)和預(yù)后較差的簇B中，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞M2、靜止肥大細胞和靜止記憶T細胞的水平較高（圖5a，圖5b）。
使用廣義線性模型，指定了區(qū)分簇B與簇A-C的免疫細胞類型（圖5c）。還測試了哪些免疫細胞類型解釋了簇A與簇B之間的差異和簇B與簇C之間的差異。
08 - 免疫簇的表型分析
通過差異基因表達分析確定了簇B中顯著過度表達的基因，與簇A和簇C相比，簇B中有909個基因分別上調(diào)。這些基因與干細胞生物學(xué)和EMT相關(guān)，如使用MsigDB31的H和C2集合的基因集富集分析（GSEA）所示（圖6a）。
為了進一步描述免疫簇與癌細胞表型之間的關(guān)系，使用了與EMT、干細胞、缺氧和增殖相關(guān)的基因集。使用GSVA方法計算了每個集群和隊列的平均基因集富集分數(shù)，該分數(shù)反映了免疫集群中每個路徑/基因集的活動。平均基因集分數(shù)的無監(jiān)督聚類將免疫簇A和C分開，而簇B被分為兩個亞組（圖6b）。這些結(jié)果表明免疫簇與干細胞/EMT相關(guān)基因特征之間存在關(guān)聯(lián)。
通過GSVA富集分數(shù)的無監(jiān)督聚類，確定了乳腺癌中兩個相互排斥的基因特征：（i）一個與增殖和胚胎干細胞樣表型相關(guān)，（ii）另一個與EMT和乳腺干細胞表型相關(guān)。增殖表型在簇C中占主導(dǎo)地位（補充圖11A），當(dāng)計算每個代謝樣品的基因集得分時也觀察到了同樣的情況（補充圖11B）。在簇B中，EMT或增殖相關(guān)特征的平均基因集得分較高（補充圖11C）。在代謝物組的樣品水平上，我們觀察到一個或另一個狀態(tài)被激活的樣品的類似模式（補充圖11D）。簇A顯示EMT和增殖狀態(tài)得分較低（補充圖11E，F(xiàn)）。
為了正式確定哪些基因集分數(shù)解釋簇B，使用廣義線性模型測試每個基因集的貢獻程度。EMT標志對簇B有積極貢獻，而增殖和細胞運動性與簇A和C相關(guān)（圖6c）。還測試了當(dāng)單獨與簇A或簇C比較時，哪種基因集得分可以解釋簇B。
09- 腫瘤表型與免疫浸潤的相關(guān)性
由于免疫簇與（i）免疫細胞類型和（ii）基因集特征相關(guān)，評估了免疫浸潤（CIBERSORT）和癌細胞特征（基因集分數(shù)）之間的關(guān)系。圖6d顯示增殖和EMT分數(shù)與不同類型的免疫細胞顯著相關(guān)。高EMT分數(shù)與巨噬細胞M2、靜息肥大細胞和靜息記憶T細胞相關(guān)，而高增殖與更活躍的適應(yīng)性腫瘤微環(huán)境相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明癌細胞表型和腫瘤微環(huán)境的組成之間存在連續(xù)性。
簇B以致瘤免疫浸潤為主，EMT信號高，但約35%的簇B也表現(xiàn)為增殖表型。為了探索簇B中的這種異質(zhì)性，以無監(jiān)督的方式根據(jù)基因特征分數(shù)將樣本分組為B1以EMT表型為主，B2以增殖為主（圖6e）。
在METABRIC和TCGA中，具有增殖表型的B2病例的預(yù)后較差（圖6f，g）。為了進一步評估基因集評分的異質(zhì)性是否伴隨著免疫環(huán)境的異質(zhì)性，作者尋求B1和B2亞群之間特異性免疫細胞類型的差異。補充圖14中的無監(jiān)督聚類顯示，兩個子聚類B1和B2都具有促腫瘤/靜息免疫微環(huán)境。總而言之，簇B中兩種相互排斥的狀態(tài)可能與預(yù)后有關(guān)；然而，簇B的一個統(tǒng)一因素是存在促腫瘤/靜息免疫微環(huán)境。
四、結(jié)論
在本研究中，發(fā)現(xiàn)了與臨床相關(guān)的免疫簇與漸進性免疫浸潤。在15個乳腺癌隊列中，跨越6101個乳腺癌樣本，腫瘤免疫浸潤中等水平的患者群預(yù)后較差，與已知的預(yù)后分子和臨床病理學(xué)特征無關(guān)。通過對群組免疫成分的表征，發(fā)現(xiàn)親腫瘤免疫浸潤與不良預(yù)后組相關(guān)。進一步的表型分析顯示乳腺癌中存在兩種相互排斥的侵襲性腫瘤表型，一種與EMT有關(guān)，另一種與增殖有關(guān)。這兩種表型都是在不活躍/促腫瘤免疫微環(huán)境上發(fā)現(xiàn)的不良預(yù)后群。
